Cell HostMicrobe | 两株益生菌或能替代抗生素预防仔猪早期断奶腹

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文献导读

缩短猪的屠宰周期和提高母猪繁殖性能的早期断奶策略已普遍应用于养猪生产过程中，然而，早期断奶引起的应激经常会导致仔猪腹泻，会增加仔猪的死亡率和降低生长性能。

因此，寻找抗生素替代品预防早期断奶仔猪腹泻对畜牧业和粮食安全至关重要。目前，粪菌移植(FMT)是胃肠道疾病的重要疗法，FMT是将来自健康供体的粪便微生物群移植到患者受体中。文章数据发现从江香猪 (CM) 仔猪（中国本地小型猪品种）对早期断奶应激引起的腹泻的抵抗力强于商品杂交长白×大白（LY）仔猪，因此将健康 CM 仔猪粪菌移植到 LY 仔猪，发现LY仔猪受体在经过FMT后显著地改善了早期断奶应激引起的仔猪腹泻。作者利用16s和ITS扩增子测序鉴定到了L. LA39（加氏乳杆菌LA39）和L.（弗氏乳杆菌）作为早期断奶小猪中潜在的与腹泻抵抗相关的微生物，并且还阐明了这两种菌是如何起抗腹泻的机理。

文献介绍 文章摘要 目前，非常需要抗生素的替代品来预防早期断奶引起的农业动物的腹泻问题。CM 仔猪（中国本土品种）比商品化杂交 LY 仔猪更能抵抗早期断奶应激引起的腹泻。LY 仔猪在断奶前通过口服健康 CM 中的粪菌，发现具有CM粪菌具有抗腹泻作用。通过比较转移生理盐水和粪菌到LY仔猪肠道菌群的相对丰度，鉴定并验证了加氏乳杆菌 LA39和弗氏乳杆菌是介导腹泻抗性的两种细菌种类。抗腹泻依赖于细菌分泌环肽 A（一种细菌素）。且 A 与宿主肠上皮细胞膜上的 KRT19角蛋白结合是必不可少的。这些发现提示加氏乳杆菌LA39和弗氏乳杆菌可作为预防哺乳动物腹泻的抗生素替代品。 实验技术路线

注：所有仔猪在21日龄断奶，FMT灌胃时间点在出生前10，12，14，16，18日龄，所有粪便采食时间点在断奶后3，5，6，8，11天。 无菌生理盐水；low dose 低剂量粪菌；high dose 高剂量粪菌； 土霉素

实验结果 1. FMT 预防仔猪早期断奶应激性腹泻

断奶前将 CM 仔猪粪便微生物群（低剂量）转移到 LY 仔猪接受者体内，显著降低了早期断奶仔猪的腹泻发生率和腹泻指数。

2. FMT 诱导仔猪肠道微生物组成的转变

C（细菌）,D（真菌）图是基于加权 距离的主坐标分析(PCoA)；E（细菌），F（真菌）图是基于 index的α多样性；G图（细菌）是基于 分析的KEGG通路的主成分分析（PCA）。

A-E图表明了细菌组成成分在不同分类水平上的转变

A是门水平，B是纲水平，C是目水平，D科水平，E是属水平。

C,D两图表明FMT 引起 LY（盐水）仔猪向 CM 仔猪肠道微生物 β 多样性（特别是细菌 β 多样性）转移，E,F两图表明FMT促使LY到CM仔猪的肠道的α多样性的转变。G图表明FMT在肠道细菌群落的功能谱中引起了从 LY（盐水）仔猪到CM仔猪的转变。下面的A-E图表明FMT 引起细菌分类学组成成分从 LY（盐水）仔猪向 CM 仔猪的转变。

3.口服抗腹泻相关肠道微生物预防仔猪早期断奶应激性腹泻

F图（细菌）种类，G图（真菌）种类的韦恩图。向上的红色箭头表示在各个采样点由FMT引起的菌的相对丰度的显著上升。这些显著变化的微生物种类是由分析所鉴定的。

为了鉴定对早期断奶应激诱导的腹泻提供抗性的特定肠道微生物，比较了在 LY（盐水）仔猪和 LY（低剂量）仔猪中鉴定的肠道微生物种类的相对丰度。数据显示，在早期断奶后至少一个采样时间点（3,5,6,8 和 11 天），LY（低剂量）仔猪中 17 种细菌种类的相对丰度显著高于 LY（生理盐水）仔猪. 其中，5 种细菌种类（L. LA39, L. , B. , E. , and B. ）早期断奶后的所有采样时间点中都存在。然而，在断奶后的所有采样时间点，LY（低剂量）仔猪与LY（盐水）仔猪比较，没有真菌种类的相对丰度显著增高.

H,I图分别代表了腹泻发生率和腹泻指标

Mix表示：五菌混合物[包括 L. LA39, L. , B. , E. , and B. ]; LG表示：L. LA39; LF表示：

L. ; BP表示：B. ; EH表示：E. ; BH表示：B. ).

转移五细菌联合体或单独灌喂L. LA39 或 L. ， 可显著降低早期断奶 LY 仔猪的腹泻发生率和指标(单独的LG,LF两种菌或者五种菌的混合与对照有显著差异,但是其余三种菌的单独品与对照无显著差异,确定起作用的是LG和LF两种菌)。

4.肠道微生物介导的腹泻抵抗依赖于分泌型 A

L. LA39分泌环状 A细菌素, 假设L. LA39 介导的腹泻抗性可能来源于 A细菌素 对肠上皮的作用。实验结果发现LY（低剂量）仔猪和 CM 仔猪的粪便细菌 A 编码基因 (gaaA) 丰度显著高于 LY（盐水）仔猪和 LY 仔猪.

五菌联合体 (Mix) 组和L. LA39 组的粪便细菌 gaaA 基因丰度均显著高于对照组和 PBS 组, 提示分泌型 A 可能促进早期断奶仔猪的抗腹泻作用。 且敲除 gaaA 基因（图 3c 和 3D）阻断了L. LA39 介导的腹泻抗性（图 3E 和 3F）和粪便细菌 gaaA 基因丰度的增加（图 3G），表明 A 对腹泻抗性至关重要。粪便L. LA39在野生型组和 gaaA 基因敲除 (6gaaA) 组之间的相对丰度无显著差异，（图 3H），表明敲除 gaaA 基因并没有改变仔猪粪便微生物群中的L. LA39的相对丰度。L. 也编码 gaaA 基因和分泌的 A（图 3i 和 3j）。这些发现揭示了早期断奶仔猪中由L. LA39 和 L. 介导的腹泻抗性依赖于分泌型 A。

5.与肠上皮细胞中的细胞质膜结合的 A 增强肠液吸收并减少肠液分泌

免疫荧光染色结果表明，断乳仔猪空肠上皮细胞中， A 与细胞质膜结合（图4A）。重组纯化的 His- A 在来自空肠 (IPEC-J2) 的培养的肠猪上皮细胞系中结合到细胞质膜上（图 4B），表明 A 在体内和体外与细胞质膜结合。

在 IPEC-J2 细胞中，His- A 显著增加了与肠道吸收相关的蛋白（NHE3、、DRA 和 PAT1）的表达，降低了与肠道分泌相关的蛋白（NKCC1、CFTR 和 CaCC1）的表达。（图 4C 和 4D），提示 A 具有重要的抗腹泻作用。

越来越多的证据表明，细胞第二信使，包括 Ca2+ 和环核苷酸，如环磷酸腺苷 (cAMP) 和环磷酸鸟苷 (cGMP)，有助于减少肠上皮液体吸收和增强肠液分泌，从而促进腹泻。结果表明，用 His- A 处理细胞后， Ca2+ 水平没有明显变化（图 4E 和 4F），而用 His- A 处理后环核苷酸（cAMP 和 cGMP）水平明显降低。（图E-J）

6. A 通过 KRT19 与细胞质膜结合对 A 介导的肠液吸收增强和肠液分泌减少至关重要

使用 His 标记的 A 和未标记的 A 作为诱饵来寻找它们的相互作用蛋白，进行免疫沉淀实验。发现 IPEC-J2 细胞中的角蛋白 18(KRT18) 或角蛋白 19(KRT19) 蛋白可能与his标签 A和 A 相互作用（图 5A）

免疫共沉淀 (coIP) 实验证实， A 与 KRT19（一种位于细胞质膜和细胞质中的蛋白）相互作用，但不与 KRT18。

敲除 KRT19 和用 KRT19 抗体处理都阻断了 A 与质膜的结合。KRT19 的敲除也阻断了 A介导的环核苷酸（cAMP 和 cGMP）水平的降低（图 5E 和 5F），肠液吸收增强和肠液分泌减少（图 5G 和 5H）.

7. A通过激活由机制靶点介导的磷酸二酯酶活性，降低细胞环核苷酸水平，增加肠液吸收和减少肠液分泌.

接下来研究了在肠上皮细胞的细胞质膜中 A 与 KRT19 结合介导的改变的肠道肠液吸收和肠液 分泌的机制。

在 IPEC-J2 细胞中，环化酶（鸟氨酸环化酶、腺苷转化酶）活性没有显著改变（图 6A-6D），而 PDE（环核苷酸） 活性显著增加（图 6E-6H）。

异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)是一种 PDE 活性抑制剂（图 6I 和 6J），可逆转 A 介导的环核苷酸水平降低（图 6K 和 6L），增强肠道吸收，减少 IPEC-J2 细胞的肠道分泌（图 6M 和 6N）。

这些数据表明，增强的 PDE 活性对于 A 介导的环核苷酸水平降低、肠道吸收增强和肠道分泌减少至关重要。

PDE 由于磷酸化而被激活。雷帕霉素机制靶点 (mTOR) 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过其磷酸化功能调节细胞代谢。我们的数据显示 mTOR 磷酸化和其两个下游蛋白（ 和 4E-BP1）的磷酸化显著上调（图 7A 和 7B），表明在用 A 处理时， mTOR 活性显著增加。

(RAPA)是一种mTOR的特定抑制剂，当用其处理时，显著降低 磷酸化和 4E-BP1 磷酸化，因此排除了 RAPA 的脱靶效应（图 7C）。

结果表明，RAPA 处理逆转了 A 介导的环核苷酸水平的降低（图 7D 和 7E），PDE 活性的增强（图 7F 和 7G），肠道 fiuid 吸收的增强和肠液分泌的减少（图 7H 和 7I）。

这些发现揭示了 A 与肠上皮细胞质膜中的 KRT19 蛋白结合，然后通过激活 mTOR 介导的 PDE（磷酸二酯酶） 活性，降低细胞环核苷酸水平，从而增加肠道肠液 吸收和降低肠道肠液分泌。

讨论

1.FMT 可预防仔猪早期断奶应激引起的腹泻，使用低剂量粪便悬浮液比使用高剂量粪便悬浮液时，FMT 的抗腹泻作用更强，这表明通过 FMT 的肠道微生物群靶向治疗可能是剂量依赖性的。因此，在通过FMT靶向治疗时最佳微生物剂量也应考虑。

2.来自肠道微生物的分泌肽可能通过直接与肠上皮相互作用来调节肠上皮蛋白的表达。本研究结果中发现KRT19 蛋白可能介导从细胞外的 A到细胞信号的信号转导。

文章意义

鉴于抗生素对全球的生态链和食品安全有不利影响，畜牧业迫切需要抗生素替代品。华中农业大学晏向华团队利用 FMT ，细菌 16S rDNA 和真菌ITS 基因扩增子测序分析鉴定了L. LA39 和 L. 作为早期断奶仔猪腹泻抗性相关的潜在微生物。这些发现表明，微生物群来源的细菌素 A 靶向宿主肠上皮以赋予早期断奶仔猪腹泻抗性，且分泌 A

的肠道微生物也可能有助于预防腹泻，分泌型 A 也可作为早期断奶仔猪抗腹泻的特异性生物标志物。

文章链接和参考文献