第二代测序（第二代测序技术）

操作过程如下:

1.测序文库的构建

首先，制备基因组，然后将DNA随机断裂成几百个碱基或更少的小片段，并在两端添加特殊的接头。如果是转录组测序，文库的构建相对麻烦。RNA片段化后，需要反向成cDNA，然后加入接头，或者先将RNA反向成cDNA，再将片段加入接头。

2.锚定桥

测序反应是在一个被称为流动池的玻璃管中进行的，这个玻璃管被细分为八个泳道，每个泳道的内表面有无数个固定的单链头。将上述步骤中获得的带有接头的DNA片段变性为单链，然后与测序通道上的接头引物结合，形成桥结构，用于随后的预扩增。

3.前置放大

加入未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥PCR扩增，将待检测的单链桥片段扩增为双链桥片段。通过变性，互补的单链被释放并锚定在附近的固体表面上。通过不断循环，在流动池的固体表面将获得数百万簇待检测的双链片段。

4.单碱基延伸测序

将四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶和接头引物加入测序流动池进行扩增。当每个测序簇延伸其互补链时，每个荧光标记的dNTP可以释放相应的荧光。测序仪捕捉荧光信号，通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

5.数据分析

严格来说，这一步不能算作测序操作流程的一部分，但只有通过这一步的前期工作才有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列。应该通过生物信息学工具将这些短序列组装成一个重叠的组甚至一个完整的基因组，或者将这些序列与现有的基因组或相似物种的基因组序列进行比较并进一步分析，以获得生物学上有意义的结果。

之一代测序、第二代测序、第三代测序各有什么优缺点？求上帝指点。

之一代指双脱氧末端终止法。扩增后用毛细管电泳读取序列，每次获得的数据量较小。第二代高通量测序采用微珠或高密度芯片合成测序，代表454、、固相、高通量，一次可获得数克数据。和三代相比，还是要通过放大的方式把信号放大，然后进行检测。

第三代的特点是单分子测序，多基于纳米技术，不需要扩增。单链DNA/RNA通过合成、降解、纳米孔等手段直接测序。最核心的特点就是不需要放大，所以成本更低。

pcr和第二代测序的区别

第二代测序是之一代测序技术划时代变革的核心。即核酸信息通过引物定位，技术平台是 /SOLiD？系统。上述技术平台使用的测序原理是环形微阵列法。

Pcr是一种扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可视为一种特殊的DNA体外复制。PCR更大的特点就是可以大幅度增加少量的DNA。

单细胞测序和三代测序有什么区别？

它们在排序方法和范围上是不同的。第三代测序是纳米孔测序技术。DNA分子通过核酸外切酶以一次一个碱基的速度通过小孔，70天左右就可以确定一个完整的基因序列。

这项技术出现在2008年左右，其阅读长度优于二代测序，不需要对样本进行扩增。但目前测序成本高，准确性差，没有大规模推广。

单细胞测序测量细胞群体中单个细胞的基因组、DNA-甲基组或转录组(scRNA-seq)。

什么是mds二代测序？

MDS的预后评估需要检测多基因突变。为了满足高通量和高灵敏度的要求，第二代测序(NGS)应运而生。NGS技术是对传统之一代测序技术的革命性变革，可以同时并行分析数十万或数百万个短DNA分子。NGS不仅测序速度快，检测深度也要深100多倍，而且可以相对定量。

目前多中心实验室的评估表明，二代测序具有较高的一致性和可重复性。更重要的是，降低了NGS的检测成本，可用于常规临床检测。因此，对AML和MDS中NGS突变的监测成为研究热点。

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