内农大/南昌大学一院-补充植物乳杆菌改善慢性便秘(IF=10.3)

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室；华润江中制药集团有限责任公司；南昌大学第一附属医院

DOI号：10.1016/j.phrs.2023.

实验设计

本研究招募了163例慢性便秘患者，所有患者被随机分为益生菌组或安慰剂组。益生菌组受试者每天饭后服用P9一袋(2 g/袋，1×1011 CFU/袋/天)持续28天，随访期14天。试验期间每日记录患者的电子粪便日记(主要结果是每周平均CSBMs，次要结果是补充P9对其他便秘相关参数的影响：每周平均SBMs频率、每周粪便稠度平均评分和每周粪便紧张平均评分(图1a))。在第0、28、42天进行PAC-QOL问卷和DASS-21量表调查；收集粪便样本进行宏基因组测序；并使用液相色谱-质谱(LC-MS)测定粪便代谢产物。

前言

慢性便秘(CC)是一种常见的功能性肠道疾病，影响全球15%的成年人，中国功能性便秘的患病率为8.5%。根据罗马IV标准，CC的典型症状是排便次数少、排便困难或排便不全。由于缺乏疗效和安全性，几乎一半的CC患者对目前的治疗不满意。越来越多的证据表明，CC的发生与肠道生态失调密切相关。胃肠运动与肠道菌群相互关联，相互影响；一些肠道微生物可以通过调节肠道菌群来加速胃肠道运输。结肠微生物代谢产物，如短链脂肪酸和色胺，也被证明可以调节胃肠道功能和宿主健康。此外，胃肠道疾病患者的肠道噬菌体与健康个体不同，一些噬菌体甚至对各种胃肠道疾病显示出很有希望的治疗效果。因此，肠道细菌、代谢组和噬菌体可以被认为是包括CC在内的宿主GI疾病预防和治疗管理的靶点。

几种主要的益生菌(如乳酸杆菌和双歧杆菌)已在动物和人体研究中用于缓解便秘。然而，由于临床试验中益生菌菌株使用、剂量、持续时间和样本量不同等原因，使得益生菌对便秘缓解效果不一致。此外，这些RCT仍局限于观察便秘相关临床指标的变化，需要阐明宿主-肠道微生物相互作用的潜在机制。因此，在评估特定候选菌株的益生菌效应时，有必要根据目标受试者队列进行临床试验，最好是样本量更大，并使用现代和可重复的微生物分析方法，以确保数据的可靠性和结果的有效性。

植物乳杆菌P9 ( P9)最初是从传统酸性稀粥中分离出来的。具有良好的益生菌潜力，对模拟胃肠液和胆汁具有较高的耐受性，较强的免疫增强活性和较强的肠道菌群调节作用。最新研究报道称，在高农药暴露的受试者中，食用P9可以促进农药残留的排泄，缓解炎症，维持肠道菌群稳态。本研究设计了纵向RCT试验，旨在进一步探索P9菌株的益生菌功能。本研究的目的是系统评估P9对缓解CC的有益作用以及与肠道细菌和代谢产物相关的潜在机制。目前试验的主要结局是每周平均CSBMs；次要结局为每周平均SBMs、粪便稠度平均评分、粪便紧张平均评分、PAC-QOL和抑郁焦虑压力量表-21项(DASS-21)的变化。本研究的第二个目的是通过分析与益生菌摄入相关的患者肠道细菌、前噬菌体和代谢物生物标志物的变化，揭示症状缓解的潜在机制。我们发现一些功能性肠道菌群、噬菌体和结肠微生物代谢的反应与摄入P9缓解便秘的效果相关。这项工作是对现有文献的宝贵补充，为了解益生菌摄入的有益机制提供了见解。

结果

1 受试者基线特征

共有163名患者被随机分为P9(n=78)或安慰剂(n=85，图S1a)两组。受试者年龄分别为22.68±5.66岁(P9组)和21.59±4.59岁(安慰剂组；表S2)。P9组和安慰剂组的男女比例分别为15:63和17:68。两组患者在基线年龄、性别比例、药物治疗、高纤维饮食习惯、吸烟习惯等方面差异无统计学意义(P＞0.18；表S2)。

2 P9可改善患者的自发排便频率

基线时(第0天)，两组患者在每周平均CSBMs频率、每周平均SBMs频率、每周平均粪便稠度评分、每周平均粪便紧张评分以及PAC-QOL和DASS-21问卷评分方面均无显著差异(图1b、1c；表S3)。干预28天后，P9组CSBMs和SBMs的周平均频率分别比安慰剂组高28%(P=0.039)和12%(P=0.039)(图1b；表S3)。在第42天，P9组CSBMs的周平均频率与安慰剂组相比显著增加，与基线相比也增加了2倍(P＜0.05)。然而，在任何时间点，两组之间的每周平均粪便稠度和紧张评分均无显著差异(图1b；表S3)。

P9对患者的生活质量也有轻微影响。PAC-QOL问卷共有28个条目，细分为四个条目，分别是担忧和困扰(WO)、身体不适、心理不适和满意度。在第14天，P9组患者的WO评分比安慰剂组低1.22倍(P＜0.05)，其他3个指标在各时间点组间差异均不显著(P＞0.05；图1c；表S3)。P9组和安慰剂组在任何时间点的抑郁、焦虑和压力水平也没有显著差异(P＞0.05，图S1b；表S3)。

两组患者均在第14天和第28天报告了部分不良事件；然而，P9组不良事件(分别为14和1起)明显少于安慰剂组(分别为20和7起；表S3)，表明P9可以缓解患者的便秘症状，提高患者的生活质量。

图1 便秘相关症状的多组学分析和临床指标。(a)研究设计流程。分析受试者的临床指标、肠道微生物宏基因组和粪便代谢组。小提琴图显示(b)临床参数和(c)患者便秘生活质量评估(PAC-QOL)问卷中的项目在益生菌(P9)组和安慰剂(Pla)组间的统计学差异，通过检验进行评估。“0d”、“14d”、“28d”、“42d”分别为干预前、干预后14、28、42天。CSBMs=完全自发排便；SBM=自发排便。

3 P9可调节患者肠道细菌组成

在第0、28和42天共采集476份样品进行宏基因组分析。经过bin细化后，总共有12854个、14904个和18133个高质量、中质量和部分质量的MAGs被分配。从高质量MAGs中共提取出706个SGBs，分布于17门、20纲、38目、77科、296属、616种。以厚壁菌门(63.17%)为主，其次为拟杆菌门(17.51%)、放线菌门(6.09%)和变形菌门(5.95%；表S4)。

为了评估P9对患者肠道细菌多样性的影响，进行了α-多样性(和指数)和NMDS分析。P9组和安慰剂组在任何时间点的和指数均未发现显著差异(P＞0.05；图2a)。NMDS分析还显示，两组间肠道菌群结构无显著差异(分别在第0、28、42天的=0.211、0.193、0.195；图2b)，表明无论益生菌摄入量如何，整体肠道细菌菌群结构都没有明显变化。

之后对两组受试者之间的差异物种进行了更详细的筛选，以调查临床指标的改善是否与物种水平的肠道微生物群的特定变化有关。在整个数据集中共鉴定出22个主要SGBs(平均相对丰度≥0.01%)，两组在基线时均无显著差异。仅在第28天和第42天检测到差异丰富的SGBs(分别为14和8SGBs；图2c；表S5)。第28天，P9组的L. 和 的数量明显高于安慰剂组，而 、 、 sp. (、 、 、 )和 的物种丰度则相反。第42天，P9组的 数量显著高于安慰剂组，而 和 sp. ( 、和 )数量则相反。此外，通过将宏基因组数据集的clean reads映射到P9参考基因组，跟踪了受试者粪便菌群中P9菌株的变化。基线时，任何受试者均未检测到P9。随着干预的进行，仅在摄入益生菌的受试者中检测到P9，而在安慰剂组中未检测到P9，尤其是在第28天(图2d)。

肠道菌群功能的另一个指标是菌群相关网络的相互联系。因此，绘制了两组主要物种的粪便菌群相关网络(平均相对丰度超过0.01%；r＞0.5或＜0.5；图2e；表S6)。与安慰剂组相比，P9组肠道菌群之间的相互联系和相关性更突出(相互相关物种：P9组134个，安慰剂组106个；相关关系数量：P9组211种，安慰剂组119种)。其中， 与 (r=0.509， sp.(r>0.5， copri与 dorei(r=-0.56， (r=-0.65，P

图2 受试者肠道菌群特征及其与便秘临床指标的相关性。(a)益生菌组(P9)和安慰剂组(Pla)在第0天(0d)、第28天(28d)和第42天(42d)的和多样性指数。(b)不同时间点P9和Pla组的非度量多维标度(NMDS)分析。代表两个干预组在不同时间点的样本的符号用不同的颜色表示。(c)干预期间和干预后，P9和Pla组之间存在显著差异的SGBs；所有显示的SGBs在基线时组间无显著差异。(d)干预过程中检测到的P9基因组相对丰度。(e)干预42天后，P9和Pla组检测到的肠道SGBs之间的相互关联网络。(f)干预42天后，两组差异丰度SGBs与便秘临床指标的相关性热图。“+”和“−”分别代表显著正相关和显著负相关(r＞0.5或＜-0.5，P＜0.05)。色标代表相关系数。CSBMs=完全自发排便；SBMs=自发排便；WO=担忧和困扰。

4 临床指标与患者肠道细菌的多变量相关性

进一步探讨了患者肠道细菌与便秘临床指标的关系。对P9组和安慰剂组之间的临床指标(CSBMs、SBMs和WO)和差异SGBs(平均相对丰度大于0.01%)进行相关性分析(界值：r>0.3， 和 与CSBMs呈显著正相关(r＞0.30，P＜0.001)， m_A 和 与SBMs呈显著负相关(r＜-0.30，P＜0.001)。在安慰剂组，SBMs与 和 呈显著正相关(r＞0.32，P＜0.001)。最后，在P9和安慰剂组中，分别有17个和10个生物标志物物种与三个便秘临床指标表现出很强的相关性(图2f)。

5 P9可调节患者的肠道噬菌体

肠道噬菌体组成被认为在宿主健康中发挥作用。我们对整个数据集的噬菌体搜索总共返回了52173个非冗余vOTUs。然后将这些vOTUs与宏基因组肠道病毒目录进行比较，并将其中32.74%的vOTUs分配给已知噬菌体家族，其中包括739个(4.33%)完整基因组，2708个(15.86%)高质量基因组和13632个(79.81%)中等质量基因组(图3a)。与CC患者的肠道细菌菌群相似，NMDS分析显示，P9组和安慰剂组的整体噬菌体群落在第0天、第28天和第42天没有表现出明显的结构差异(应激=0.20、0.17和0.18；图3b)，表明P9并没有引起噬菌体整体群落的明显变化。同样，在任何时间点，两组间肠道噬菌体α多样性均未发现显著差异(图3c；P＞0.05)。

之后对比分析了P9和安慰剂组粪便宏基因组中不同位点的噬菌体组成，以确定与益生菌干预相关的差异丰富噬菌体。6个亚组(P9和安慰剂组在第0、28和42天)的噬菌体谱高度相似，包括10个不同的科；、和是所有亚群中最占优势的科(图3d)。P9与安慰剂组之间检测到一个差异丰富的噬菌体科，即，在第0天组间无差异，但在第28天P9组明显缺失(P=0.014与安慰剂组比较；图3e)。尽管它的相对丰度在第42天反弹，但在数值上仍然低于基线水平。

然后，在数据集中分析了肠道细菌菌群和噬菌体的相关性。肠道细菌与噬菌体菌群指数相关性较强(R=0.895，P＜0.001；图3f)，分析结果一致(相关性=0.743，P=0.001；图3g)。细菌和噬菌体菌群的组成和多样性之间的高度协同性可能表明肠道噬菌体对其细菌宿主具有高度的感染特异性。接下来绘制了P9和安慰剂组粪便菌群之间检测到的肠道噬菌体和差异SGBs的相关热图。与安慰剂组相比，P9组相关性更高(57个显著正相关，3个显著负相关，而安慰剂组有21个显著正相关，2个显著负相关；P＜0.05；图3h)，表明P9组有更强的互联性。特别是和与多个代表成员的SGBs呈正相关；与多个代表普拉梭菌的SGBs呈正相关(所有情况r>0.40)。是P9和安慰剂组之间差异丰富的噬菌体科，与多个细菌分类群表现出强烈的显著正相关，包括 、 、 和 (r>0.5；图3h)。这些结果表明，补充益生菌可以影响CC患者的肠道噬菌体组成。

图3 慢性便秘受试者在干预期间/之后肠道噬菌体的变化。(a)噬菌体宏基因组的科水平分类分布。我们的数据集包含52173个合格的DNA病毒操作分类单元(vOTUs)。(b)益生菌组(P9)和安慰剂组(Pla)在不同干预时间点(第0、28、42天分别用0d、28d、42d表示)肠道噬菌体的NMDS分析。代表两组不同时间点样本的符号用不同颜色表示。(c) 多样性指数，(d)噬菌体科水平分布，(e) P9组和安慰剂Pla组在干预过程中科相对丰度的变化。(f)肠道细菌菌群多样性指数与噬菌体的相关性；呈正相关(R = 0.895；P＜0.001)。(g)对P9组和Pla组在不同时间点的肠道SGB和噬菌体进行分析，表明肠道细菌与噬菌体之间存在正协同性(相关系数=0.743；P=0.001)。(h)干预后P9和Pla组中SGBs与肠道噬菌体之间的关系。“+”和“−”分别代表显著正相关和显著负相关(r＞0.4或＜-0.4，P＜0.05)。颜色标度代表相关系数。

6 P9可调节患者肠道代谢模块和生物活性代谢物

探索了益生菌对GMMs的特异性作用，并使用预测了生物活性化合物。鉴定出70种GMMs；S-腺苷甲硫氨酸合成(672个SGBs)、乙酸合成I(662个SGBs)、喹啉酸降解(657个SGBs)和谷氨酸合成I(607个SGBs)是覆盖范围最大的四个代谢模块，主要分布在厚壁菌门(＞62%)和拟杆菌门(＞18%；表S7)。进一步计算并对比分析了两组从高质量MAGs中提取的706个SGBs中GMMs的累积丰度，发现P9组中含有更多编码γ-氨基丁酸和次级胆汁酸生物合成GMMs的基因以及几种氨基酸(半胱氨酸、酪氨酸和苏氨酸)降解GMMs的基因(表S8；图4a)。第28天，P9组组胺合成模块水平明显低于安慰剂组(P=0.046)，肌醇降解模块水平也明显低于基线(图4b，P=0.02)。

通过的进一步分析显示，总共有80种肠道生物活性代谢物，在基于这些代谢物的NMDS分析构建的总体谱图中，没有观察到明显的组间差异(第0、28、42天的=0.11、0.08和0.09；图4c)。然而，进一步的分析确定了5种益生菌治疗反应性代谢物，在试验期间和/或之后显示出显著的组间/组内差异，但在基线时没有差异(图4d；表S9)，包括：第28天，P9组植物鞘氨醇和鼠胆酸含量高于安慰剂组(P=0.003和0.04)；在第28、42天，尿嘧啶和丙酸咪唑含量较第0天降低(P=0.047、0.03)；与第28天相比，P9组第42天壬二酸盐含量增加(P=0.05)。表明CC患者生物活性代谢物的这些变化可能与P9有关。

图4 第28天和第42天肠道代谢模块(GMMs)和预测代谢物谱的变化。(a)选定的GMMs(与便秘的发展、病理生理学和免疫有关)在门中的分布。色阶显示GMMs模块中编码的SGBs的数量。(b)在干预过程中，益生菌组(P9)和安慰剂组(Pla)之间组胺合成和肌醇降解的累积丰度有显著差异。P值由检验产生。(c)不同时间点P9和Pla组GMM的非度量多维标度(NMDS)分析。代表两组不同时间点样本的符号用不同颜色表示。(d)箱线图显示对益生菌处理有反应的预测差异生物活性代谢物的含量。显著了样本对之间经过-程序校正的P值，校正后的P＜0.05认为有统计学意义。

7 P9可调节患者的粪便代谢组

分析了不同时间点粪便代谢组的组间差异。不同亚组粪便代谢组以及正负离子模式下QC样本的PCA评分图如图S2a所示；表示QC样品的符号在评分图中高度聚集，表明仪器和色谱条件具有良好的稳定性和可靠性。PCA图在三个时间点上没有显示出组/亚组之间的明显差异(图5a)。然而，PLS-DA分析显示，益生菌组和安慰剂组在第28天和42天的粪便代谢组存在明显差异(图5b)。为了确定益生菌干预期间/之后代谢组的确切变化，以VIP＞1.0和P＜0.05为阈值筛选代谢物，在第28天和42天，P9组和安慰剂组之间分别鉴定出17和11种差异代谢物(图5c；表S10)。在基线时，P9和安慰剂组之间这些特征没有显著差异。与安慰剂组相比，P9组在第28天的戊酸、L-天冬酰胺和L-半胱氨酸含量显著增加；在第42天辛酸和L-哌啶酸显著增加(所有情况P＜0.05；图5d)。此外，在P9干预期间/之后，苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等几种氨基酸代谢途径都得到了富集(图S2b)。这些结果表明P9给药伴随着受试者粪便代谢组中某些代谢途径的改变。

之后进行了相关分析，以确定P9和安慰剂组中差异丰富的代谢物与SGBs之间的关联，结果分别为71个和49个正相关(r=0.30，P＜0.001；表S11)。没有发现负相关。有趣的是，一些已知与肠道屏障和转运有关的代谢物被发现与一些差异SGBs表现出显著的正相关性，包括：对甲酚和 (r=0.30，P＜0.001)；辛酸与 (r=0.45，P＜0.001)；甲胺与 (r=0.34，P＜0.001；表S11)。

图5 慢性便秘患者干预期间/干预后粪便代谢组的变化。干预期间益生菌组(P9)和安慰剂组(Pla)粪便代谢组的(a)主成分分析(PCA)和(b)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)评分散点图(第0、28和42天，分别用0d、28d和42d表示)。代表两组不同时间点样本的符号用不同颜色表示。(c)通过液相色谱/质谱法(LC/MS)检测，P9组和Pla组在第28天和第42天的代谢产物存在显著差异。在第0天，两组间这些代谢物的数量无显著差异。x轴为倍数变化(比值尺为log2)，y轴为P值的负log10(数值越大，统计学显著性越强)。通过对两组代谢组数据集的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得出变量投影重要性(VIP)评分。(d)箱线图显示对P9处理有反应的粪便代谢物水平之间的比较。显示了样本对之间经过-程序校正的P值，校正后的P＜0.05认为有统计学意义。

8 多组学关联网络分析

为了量化P9对患者多组学特征的影响，采用RFCV R评估每对特征之间数据预测的准确性(RFCV R＞0.1，＞0.3和＞0.5代表两个变量之间的低、良好和出色的预测性能)。数据显示，与安慰剂组相比，P9组的预测性能普遍更高，其中噬菌体和SGBs的预测性能最高(图S3)。此外，临床指标对噬菌体和SGBs的预测性能(RFCV R>0.3)明显优于活性代谢物和代谢产物(RFCV R>0.12；图S3)。

讨论

慢性便秘是临床常见的胃肠疾病，严重影响患者的生活质量，增加社会压力和经济负担。既往研究表明，补充益生菌可以通过维持胃肠稳态、改善肠道屏障功能来缓解便秘。然而，结合多组学分析，系统解读特定益生菌缓解便秘的作用及其潜在机制的大规模RCT有限。因此，我们开展了一项随机、双盲、安慰剂对照试验，共纳入163名受试者，以评估P9缓解CC的疗效。我们监测了受试者肠道细菌和噬菌体菌群以及粪便代谢组在干预后与CC临床指标相关的变化。结果有力地支持了P9可以有效地缓解便秘，缓解效果与粪便细菌组、噬菌体和代谢组的预期变化有关(图6)。

研究结果显示，P9能显著改善患者排便频率。与服用安慰剂的患者相比，服用P9的患者CSBMs水平显著升高(1.5倍)，并且在停止摄入益生菌14天后仍然观察到这种有益效果。干预28天后，P9组的每周平均SBMs比安慰剂组高12%，表明P9组受试者有明显改善。但对粪便稠度或紧张评分没有显著影响。然而有研究显示改善了粪便稠度。这一差异可能是由于研究之间使用了不同的益生菌菌株。之后使用PAC-QOL和DASS-21两份问卷来评估患者的生活质量、焦虑和抑郁水平。P9组除WO亚得分在干预过程中明显低于安慰剂组外，其余大部分测试参数亚得分组间无显著性差异。

为了阐明P9在缓解便秘中的有益机制，进行了深入的粪便宏基因组学分析。尽管与安慰剂组的受试者相比，益生菌组表现出一定程度的症状改善，但肠道菌群和噬菌体的变化不剧烈。患者肠道细菌和噬菌体的多样性指数在组间和组内(同一组不同时间点)均无明显差异，说明P9的应用并未引起其α多样性的明显变化，这也与观察到的粪便细菌组和噬菌体数据集的α多样性具有正协同性相一致。此外，P9相关的便秘症状缓解效果并不归因于宿主肠道细菌组和噬菌体的宏观变化。因此，推测P9的有益作用归因于宿主肠道菌群的微观调节。因此，在更精细的分类水平上确定了P9组受试者肠道细菌和噬菌体的纵向变化。

本研究发现了几种在P9组显著富集的潜在有益SGBs，如L. 和 。与此同时，P9受体粪便微生物组中P9基因组的丰度持续增加，直到第28天。L. 的部分富集比例可直接归因于P9的摄入。其他一些可能参与缓解便秘效果的益生菌应答菌( sp.、 sp.、 )和噬菌体()在P9干预后显著减少。 sp.与SBMs呈显著负相关，而与和病毒科呈显著正相关。另一个与SBMs呈负相关的分类单元是 sp.，而与呈正相关。P9组受试者中较少，与 sp.(属于厚壁菌门)呈正相关。表明P9缓解便秘的效果伴随着一些与健康相关的肠道细菌和噬菌体的理想变化。

在食用P9的受试者中，肌醇降解和组胺合成途径的累积基因丰度下降，此外有更多的SGBs参与次级胆汁酸生物合成、赖氨酸和苯丙氨酸降解。苯丙氨酸代谢和赖氨酸降解是本研究中摄入P9的受试者粪便代谢组中富集的主要途径，支持了它们在食用P9后缓解便秘的作用。在第28天，P9和安慰剂组之间预测的肠道生物活性代谢物谱有显著差异。例如，与安慰剂组相比，P9组预测的植物鞘氨醇和壬二酸盐水平显著升高。在P9组的粪便代谢组中，也有显著富集的壬二酸盐。这些预测活性代谢物的变化可能有助于P9干预后便秘症状的缓解。

进一步评估了受试者粪便代谢组在益生菌干预下的变化。P9组受试者的粪便代谢组中富集了几种氨基酸代谢(L-天冬酰胺和L-哌啶酸)和短链脂肪酸代谢(戊酸)的代谢物。此外，症状缓解效果也伴随着粪便戊酸盐水平的增加。干预后P9组粪便代谢组中对甲酚、甲胺、三甲胺含量较安慰剂组减少。对甲酚与 sp.之间存在显著的正相关。因此，P9组受试者肠道中对甲酚的减少可能有助于加速肠道转运。在P9和安慰剂组之间发现的其他差异粪便代谢物是三甲胺和甲胺。甲胺与 呈显著正相关， 是一种已知的损害肠道粘膜屏障的物种。因此，P9干预后结肠甲胺和三甲胺水平的降低可能改善便秘患者的肠道屏障稳态。总体而言，P9和安慰剂组之间发现的粪便代谢物和代谢途径的差异可能有助于减少炎症反应和便秘。

图6 植物乳杆菌P9(L. P9)调节宿主反应和缓解便秘的益生菌机制和途径。CSBM、SBM和WO分别代表完全自发排便、自发排便以及担忧和困扰。

结论

本研究表明，使用P9可以有效地缓解成年人的慢性便秘，并改善他们的生活质量。P9症状缓解的潜在机制不是通过宏观水平上受试者肠道宏基因组和代谢组的变化，而是对某些功能性肠道菌群、微生物代谢产物和代谢途径进行微调。本研究为未来探索益生菌在胃肠道疾病管理中的应用提供了有价值的信息。

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